Hỗn hợp mẫu để phân tích và tách có thể tích rất nhỏ được đưa vào dòng pha động đang thấm qua cột. Những thành phần của mẫu đi qua cột với tốc độ khác nhau, đây là chức năng của những tương tác vật lý cụ thể với chất hấp phụ của cột (còn gọi là pha tĩnh). Tốc độ của từng thành phần phụ thuộc vào bản chất hoá học tự nhiên nó trên pha tĩnh và thành phần của pha động. Thời gian mà một chất phân tích rửa giải ra khỏi cột gọi là thời gian lưu. Thời gian lưu được đo trong những điều kiện đặc trưng và được xem là đặc điểm nhận biệt của chất đem phân tích.

Có nhiều loại cột khác nhau, được làm bằng những chất hấp phụ có kích thước hạt và bề mặt tự nhiên thay đổi. Việc sử dụng những vật liệu có hạt có kích thước nhỏ hơn đổ cột yêu cầu áp suất hoạt động cao hơn và điển hình cải thiện độ phân giải sắc ký (mức độ phân tách giữa những chất phân tích đi ra từ cột nối tiếp nhau). Xét về bề mặt hóa học, những hạt hấp phụ có thể có cực hay không cực.

Các pha động thường được sử dụng bao gồm sự kết hợp có thể trộn lẫn của nước với dung mỗi hữu cơ khác nhau (phổ biến nhất là acetonitrile và methanol). Một số kỹ thuật HPLC sử dụng dung môi không nước. Thành phần nước trong pha động có thể có axít (axít formic, photphoric hay trifluoroacetic) hoặc muối để hỗ trợ sự phân tách các thành phần mẫu. Thành phần pha động có thể được giữa cố định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi (rửa giải gradient) trong quá trình phân tích sắc ký. Rửa giải đẳng dòng đặc biệt hiệu quả trong phân tách những thành phần mẫu không khác nhau nhiều về ái lực của chúng với pha động. Với rửa giải gradient thành phần của pha động được thay đổi từ thấp tới cao để tăng sức rủa giải. Sức rửa giải của pha động được phản ánh bằng thời gian lưu của mẫu, sức rửa giải cao thì thời gian lưu của mẫu ngắn.